Остани ако можеш...

На какво сме готови за още няколко години или дори няколко месеца повече? Какъв би бил света, ако любимото ни същество би могло да бъде възможно най-дълго с нас?
Какво бихме дали да усещаме влажния му нос малко по-дълго? Възможно ли е дори ние, хората да бъдем по-дълго на тази земя? За някои от нас отговорът може би бил ясно и силно "всичко". Но какво всъщност знаем за ползите и рисковете от препаратите за удължаване на живота на кучетата, които са в процес на тестване в момента? Какви биха били последствията ако нашият любимец също е подложен на този експеримент? А защо всъщност успехът на тези медикаменти би имал и негативни страни? Редно е да сме запознати с всички възможности, рискове и неизвестни преди да отговорим твърдо "да", когато ни се предложи такава възможност във ветеринарния кабинет. Наистина ли искаме Лъки да живее по-дълго? А на каква цена?

А представяте ли си, че в момента се правят изследвания в  които тези мисли да бъдат реалност. От момента на възникване на цивилизациите, чак до сега, хората са търсели варианти, решения и начини да се справят не само със заболяванията, но и с това как да живеят по-дълго. А, това желание се запазва и до днес. 
​
Стареенето е свързано с прогресивно отслабване на имунната, склетната и мускулна системи. Това води до намалена функционалност на определени клетъчни типове и намален регенеративен капацитет. Дисфункционални системи или подобни проблеми в организма, автоимунни, метаболитни и хормонални проблеми (Parhitko et al., 2023).

Фигура 1. Графичен абстракт на процес за разработка на медикаменти за удължаване на живота

През годините интереса на учените се е засилвал към откриването на онова хапче (фигура 1), което ще може да повлияе цялостно организма ни и да бъдем вечно с нашите животни. Такъв проект е бил създаден и в процес на развитие през последните години и към днешна дата, обаче няма категорични данни, за да разгърне потенциала на „магичността“ на организма в Dog Aging projects. По-рано, през 2023г., в света на домашните любимци излезе новината, че през 2026 могат да се възползват от нов поглед към удължаването на живота чрез LOY-001. Въпреки, че все още се генерират данни, ветеринаромедицинските лица участващи в проекта, обещават успех (Smith, 2023). 

Този проект ни насочва към размисли, като например въпроса каква е разликата между еднодневката и слона? Защо възрастното насекомо има толкова кратък живот спрямо едрия бозайник? Най-очевидният отговор е размера. По-големите животни живеят по-дълго, поне в голяма част от случаите (Speakman, 2005). Обратното се наблюдава при различните породи кучета - едрите кучета като цяло имат по-кратък живот (Greer et al., 2007). Именно върху това работи компанията “Loyal”. LOY-001, -002 и -003 - продуктите в период на тестване на “Loyal” - целят понижаването на нивата на IGF-1 (инсулиноподобен растежен фактор 1) който е в по-голямо количество при едрите породи (Halioua, 2023; Greer et al., 2011). Известно е, че циркулиращите нива на IGF-1 са пропорционално свързани със скоростта на стареене при мишки (Yuan et al., 2009), а различната степен на чувствителност на рецепторите към IGF-1 може да обясни защо някои хора живеят по-дълго от средното (Suh et al., 2008). 

В същото време се извършват проучвания относно ефективността и на други препарати. Усилията на Kaeberlein et al. (2016) са насочени към рапамицин (rapamycin), който удължава живота и подобрява когнитивната функция, сърдечната дейност и рисковете от развитие на рак при мишки в лабораторни условия (Johnson et al., 2015; Kaeberlein, 2014). При хора и мишки рапамицин подобрява имунната функция (Mannick et al., 2014, Kaeberlein, 2014). 

Процесът на стареене на напълно диференцираните възрастни клетки включва няколко сложни процеса:

• понижена продукция на стволови клетки
• намалена способност за делене и растеж на клетките
• дерегулация на неврохормоналната сигнализация поради възпалителни реакции
• увреждащото действие на свободните радикали
• въздействието на растежния хормон и инсулиноподобния растежен фактор 
• генетична нестабилност (лезии в клетъчната и митохондрийната ДНК, предизвикани от радиация, химически токсини, грешки, настъпили при клетъчното делене) 
• увреждане на ядрената ламина (слой от протеини и филаменти, покриващ вътрешната мембрана на клетъчното ядро) и митохондриите
• нарушаване на протеостазата като неправилна стабилизация (Petralia et al., 2014; López-Otín et al., 2013).
• ​
  

Освен клетъчните процеси на по-високо ниво има промени в:

• Теломери, хромозоми и мутации на ниво ген, посттранслационни модификации, транспозони, малки РНК
• Метаболитните процеси
• Консервативни механизми като WNT/β-catein, PI3K/AKT, JACK/STAT, Notch
• Транскрипционни фактори: FOXO, Nrf2

Фигура 2. Графично представяне на потенциалните промени след прием на LOY

На какво обаче се основава това и какво е по-различното на LOY-001,2,3? 
За да разберем на какво се основава това „лекарство“ трябва да знаем на какъв принцип действа и защо. В клетките на всеки организъм има процеси, механизми, които имат една и съща задача и една и съща цел. Това са т.н. консервативни механизми- те помагат на телата на организмите да се движат, овладяват, функционират както помежду си, така и в самият организъм (фигура 2). 
​
Механизмите на дълголетието или процесите, които водят до по-дълъг живот, са сложни и многобройни. Изследователи в областта на биологията, генетиката и геронтологията са открили редица елементи и пътища, които допринасят за това защо някои хора или видове живеят по-дълго. Но за да си представим колко мащабно е дори само едно малко проучване, трябва да имаме предвид доста неща (Lee et al., 2021; Fan et al., 2023). 

Клетъчни процеси:

• Клетъчно стареене: Ограничената способност на клетките да се делят и да натрупват „грешки“ т.н. мутации повлиява на стареенето. На една клетка-на тъкан, на орган, следователно на организъм. И дори и например кожата ни, да има сравнително добри възтановителни и регенеративни процеси, то можем ли да повлияем цял един организъм? (Ratajczak et al., 2012)
• Поддържане на теломерите: Теломерите, части от хромозомата, тази плътно нагъната генетична информация, играят роля в клетъчното стареене. Поддържането на дължината на теломерите е свързано с дълголетието бе установено в миналият век. Но днес, вече знаем че това не е достатъчно (Adwan Shekhidem et al., 2019; Ratajczak et al., 2012).

Метаболитна регулация:

• Ограничаване на калориите: Установено е, че намаленият прием на калории без недохранване увеличава продължителността на живота при различни същества. Смята се, че влияе върху метаболитните пътища и подобрява механизмите за възстановяване на клетките (Ladraa et al., 2022; Vogt and Hobert, 2023).
• Сигнализиране на инсулин/IGF-1: Сигналната система за инсулин и инсулиноподобен растежен фактор-1 (IGF-1) е свързана с продължителността на живота. По-ниските нива на инсулин/IGF-1 сигнализация са свързани с по-дълъг живот както в клетки, така и в организми (Vogt & Hobert, 2023).

Пътища за реакция при стрес на клетъчно ниво:

• Автофагия: Клетъчната автофагия, процесът на елиминиране на повредени или неправилно функциониращи клетъчни компоненти, е от съществено значение за клетъчното здраве и е свързана с поддържането на продължителността на живота (Aman et al., 2021; Hensen et al., 2018; Locatelli & Cenci, 2022).
• Протеини от топлинен шок: Тези протеини помагат на клетките да реагират на стрес и да запазят протеините непокътнати (Peinado-Ruiz et al., 2022). Те допринасят за дълголетието, като предотвратяват увреждането на клетките (Kourtis et al., 2012). Няколко проучвания доказват връзката в моделни организми с IGF-1 (Angelini et al., 2022).

Стрес и психично състояние:

• Постоянният стрес и хроничното възпаление е свързано с нарушения на цялостната система на тялото и стареенето. Дълголетието често се свързва със способността ни да овладяваме не само психичният стрес в днешният свят, но и физическият. Стресът под каквато и да е форма оставя трайни отражения в нашият организъм и епигенетиката има ясни данни за това (Prather et al., 2015; Vila et al. 2021). 

Генетични фактори:

• Възстановяване на ДНК: Ефективните системи за възстановяване на ДНК допринасят за геномната стабилност, като ограничават натрупването на мутации, които могат да причинят стареене. И въпреки, че звучи много лесно, реално има толкова много детайли, че дори няколко суперкомпютъра не биха могли да изчислят какъв точно би бил резултата след „външна“ намеса

Гени за дълголетие - има ли такива? Някои гени, известни също като „гени за дълголетие“ или „гени против стареене“, са свързани с по-дълъг живот в много организми. Това са части от нашите генетични заложби. Това може и да са елементи от нашето ДНК, които да регулират, „прескачат“ и контролират определени процеси на тази фина машина – тялото. 

• Wnt/ β - catenin сигнализиращият път играе решаваща роля в различни клетъчни процеси, включително регенерация на тъкани, поддържане на стволови клетки и регулиране на решенията за съдбата на клетките. Тези процеси са взаимосвързани със стареенето и дълголетието. Сигналният път участва в хомеостазата и възстановяването на тъканите. Правилното функциониране на стволовите клетки е важно за регенерацията на тъканите и „замяната“ на увредените клетки. Регулацията на Wnt и стареенето е сложна и зависима от редица сигнали и най-често се свърза с подобрен регенеративен капацитет (Lin et al., 2021).
• FOXO3- вариациите в гена FOXO3 са свързани с увеличена продължителност на живота при определени популации. Теорията за дълголетие засягаща FOXO се основава на идеята, че активирането на белтъците FOXO може да допринесе за удължаване на продължителността на живота и подобряване на периода от живота, прекаран в добро здраве. Няколко изследвания предлагат връзка между белтъците FOXO и дълголетието, особено при моделни организми като червеи, мухи и мишки. Важно е да се отбележи, че дълголетието е сложен процес, влияещ от различни генетични и консервативни механизми, фактори на околната среда и начин на живот. Хомолог при най-известният моделен организъм Caenorhabditis elegans за продължителност на живота е DAF-16. DAF-16 е необходим за функцията на AMPK, свързана с регулация на оксидативен стрес и продължителност на живота. Генетичните манипулации, които подобряват активността на DAF-16, могат да удължат живота на червея и текат проучваняи при други моделни органзими (Lin et al., 2001; Sen et al., 2020).
  
• APOE (Аполипопротеин Е): Генът APOE има различни алели - основни варианта или алела на гена APOE: ε2, ε3 и ε4. APOE4 е свързан с повишен риск от свързани с възрастта състояния, като болестта на Алцхаймер. Въпреки това, алелът APOE2 е свързан с потенциално дълголетие и по-добра когнитивна функция в по-напреднала възраст, свързан със защитни ефекти срещу болестта на Алцхаймер, и някои изследвания предполагат, че лицата с ε2 алел може да имат леко по-дълъг живот Повлияват метаболизма на липидите и транспорта на холестерола. APOE ε3 алелът е най-честият вариант и не се наблюдават промени в неговата функция (Deelen et al., 2019; Lin et al., 2021; Nalini Raghavachari, 2020; Zhao et al., 2022)
• SIRT1 е член на семейството от гени, участващи в регулирането на клетъчните процеси, свързани със стареенето. Активирането на SIRT1 е свързано с увеличена продължителност на живота в различни организми. Сиртуините са семейство високо консервирани NAD+-зависими ензими, които играят ключова роля в клетъчни процеси като поправка на ДНК, възпаление, метаболизъм и стресов отговор. Има значителен интерес към потенциалната роля на протеините в стареенето, по-точно т.н. сенесенс и продължителността на живота (Grabowska et al., 2017; Morselli et al., 2010; Imai & Guarente, 2016).
• KLOTHO: Генът KLOTHO участва в регулирането на процесите на стареене. Генетичните вариации, които влияят върху експресията на KLOTHO, са свързани с дълголетие и намален риск от свързани с възрастта заболявания. Протеинът Klotho функционира като циркулиращ хормон, който се свързва с рецептор на клетъчната повърхност и потиска вътреклетъчните сигнали на инсулин и IGF1, еволюционно запазен механизъм за удължаване на продължителността на живота и въздейства върху функциите на инсулин и фибробластичен растежен фактор (FGF), Wnt и N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) (Castner et al., 2023, Kurosu et al., 2005; Prather et al., 2015).
• NRF2 (фактор 2, свързан еритроиден ядрен фактор 2): Участва в клетъчната защита срещу оксидативен стрес. Активирането на NRF2 е свързано с увеличена продължителност на живота и подобрена продължителност на здравето. Транскрипционният фактор е отговорен за предпазване от оксидативен стрес. В допълнение се включва в регулация на редица консервативни пътища, влиящи на диференциацията, продължителността на живот, стрес. Неговото повлияване със сигурност би дало положителен отзвук при повлияване продължителността на живот (Storz, 2006) 
• GH/IGF-1 ос. Въпреки че, не са единичен ген, гените, включени в оста GH/IGF-1, колективно играят роля в регулирането на растежа и развитието. Модулирането на този път е свързано с дълголетиe и именно него ще разгледаме по-подробно. Ще разгледаме с кои други пътища си коминукира и в кои тъкани може да се регулира към момента (Jiang et al., 2022;Quarrie, 2004). 

Изследванията върху препаратите, удължаващи живота, се концентрират върху отделни аспекти върху процеса на стареене и до момента нито един от тях не обхваща мнозинството от тях. Дали това би било достатъчно за значително подобрение в продължителността на живота тепърва предстои да проследим. 

Съмнението, че удължаването на живота всъщност може да е съпроводено с удължено страдание, е напълно оправдано. В експерименталните модели следва да бъдат включвани кучета, които са подложени на обективна оценка на цялостното здраве. Според Kaeberlein et al. (2016) удължаването на живота не носи непременно удължаване на страданието, защото добавените години биха били прекарани в по-добро здраве наред със забавения процес на стареене на клетките. Това разбира се е възможно само ако пациентите не са носители на скрити заболявания. 

Механизмите на регулация от клетката до цялостния организъм имат своите нива и за да сме сигурни, че ще удължим живота трябва да знаем всяко едно от тях. Въпреки това, редица консервативни механизми са намесени в регулацията на този сложен процес, разглеждайки ги от биологично естество. Клетъчни процеси, метаболитна регулация, предпазване на клетките от стрес или резорбция – всички тези нива се регулират от хиляди малки молекули, транскрипционни фактори (Lee et al., 2021; Fan et al., 2023). В допълнение намесата на епигенетичните промени може много да повлияе на нашите гени (Ladraa et al., 2022; Vogt and Hobert, 2023).  А, какво ще стане ако вземем предивид и психолгичното състояние на индивида? (Prather et al., 2015; Vila et al. 2021)

Посочихме някои от основните таргетни пътища, молекули, фактори влияещи на продължителността на живота ни. Задълбочаването в света на инсулиноподобен фактор 1 ще бъде ключова за разбирането ни за механизма на това вещество. 
​
Сигнални пътища от които калориина рестрикция и рестрикция на протеини в диетата удължават продължителността на живота, включват тези, активирани от IGF-1 и инсулин, и включват фактори по веригата, включително фосфоинозитид 3-киназа (PI3K), мишена на бозайник на рапамицин комплекс 1 (mTORC1), протеин-киназа A (PKA), AMP-активирана протеин киназа (AMPK), активиран от пероксизомен пролифератор рецептор гама коактиватор 1 алфа (PGC-1α), сиртуини (SIRT) и транскрипционни фактори (FOXO), това са добре установени, че регулират или влияят на стареенето и дълголетието (Salminen et al., 2008; Vogt & Hobert, 2023). Tе  могат да имат силно въздействие върху сигналните пътища (Parkhitko et al., 2023). Необходимо да се идентифицират нови и оптимизирани механизми за повлияване продължителността на здравето, като минимизирате страничните ефекти и тежестта наложени от хронични състояния и интервенции (фигура 3). Тези изследвания биха могли да позволят идентифициране на специфични диетични режими, ефективни при забавяне, и дори частично обръщане, стареене и свързани с възрастта заболявания (Lee et al., 2021). Има няколко установени пътища на комуникация между клетките, включващи кростолк (crosstalk) с IGF-1

Фигура 3. Илюстрация на потенциалните ефекти на метаболизма при прием на LOY

IGF-1 се открива във всички тъкани и клетки. Свързва се с други сигнални пътища, отговорни за редица процеси в организма. Това включва както възстановителни процеси, за предпазване или прогресия на заболяването. 

Изследвания на организми като червеи, мухи и мишки показват, че мутации или намеси, намаляващи сигнала, могат да доведат до увеличение на продължителността на живота. Тези резултати са предмет на интерес относно възможните механизми за хората, но дългосрочните ефекти и потенциалните рискове не са напълно разбрани. Освен това, реакциите на индивидите към намеси, целящи манипулиране, блокиране или увеличаване на даден сигнал, могат да варират в самият индивид (Deelen et al., 2019).

Изследванията в областта на биологията на стареенето и спортната медицина се интересуват от ролята на IGF-1 в процесите на растеж и обновяване на организма. IGF-1 играе важна роля в регулацията на растежа и развитието на клетките в организма. Той подпомага растежа на костите и тъканите, насърчава деленето и развитието на клетките, както и подобрява тъканевата регенерация. Освен това, IGF-1 има и други функции, като регулиране на метаболизма, влияние върху мускулната маса и регулация на нивата на глюкоза в кръвта.

Да разгледаме как IGF влия на живота на клетките в различните тъкани. Тогава бихме имали по-ясна представа за това как удължаването на живота ще повлияе цялото ни биологично съществуване, а дали не е и ментално?

• Инсулинът и инсулиноподобните растежни фактори (IGFs) стимулират различни важни физиологични процеси, като метаболизъм, диференциация и растеж. При промяна и неправилно функциониране, като постранслационни механизми и/или мутации, се повлияват редица нарушения в предаването на сигналите и води до метаболитни нарушения (Gao et al., 2022).
• Предаване на информация в невроните

Инсулинът също влияе върху концентрациите на невротрансмитерите в ЦНС, като ацетилхолин и норепинефрин, които влияят на когнитивното представяне. Ето защо въз основа на това се излседва етиологията и симптомите на Алцхаймер. Инсулинът е свързан с молекулярни и неврофизиологични аспекти на обработката на паметта Aman et al., 2021; Craft and Watson, 2004).
​

• Клетки на сърцето също се влияят от IGF

Някои доказателства сочат, че сигнализирането на IGF-1 чрез активиране на PI3K-Akt има благоприятен ефект срещу сърдечна фиброза, регулира оцеляването, хипертрофията и стареенето на кардиомиоцитите (Ock et al., 2021) .

• Влияние на при неоплазии

По-високите нива на IGF-1 са асоциирани с по-голям риск от рак в човека, тъй като този фактор насърчава клетъчния растеж и пролиферацията (Kwon et al., 2023). От друга страна, ниски му нива са свързани с определени състояния, като намален мускулен тонус и когнитивен спад.
Регулаторните механизми, по-конкретно Noncoding RNAs (ncRNAs), могат да се модулират, като намаляват нивата на фактора и вопдят до супресия на развитието на неоплазии (Kerr and Baxter, 2022). 

• Повишаване на когнитивните свойства на органзима

IGF-1 влияе върху развитието на невроните и различни функции в мозъка и участва в антидепресантните ефекти. Системното и централно прилагане на IGF-1 води до устойчиви (най-малко 6 дни) подобни на антидепресанти поведенчески ефекти при различни модели на депресия при гризачи (Deyama et al., 2022; Prather et al., 2015).

Дългосрочните странични ефекти на препаратите за удължаване на живота на кучетата също са недостатъчно проучени. Дали рисковете от тяхното приложение са оправдани наред с възможните ползи?
​
За съжаление цената на новите препарати може да е лимитиращ фактор за мнозина собственици и техните любимци. Но препаратите и експерименталните добавки не са единствения начин да удължим живота на кучето. Голяма част от факторите, които оказват влияние върху смъртността, са в наши ръце:

• надномерното тегло, особено ако се наблюдава още в млада възраст, има негативен ефект върху продължителността на живота (Lawler et al, 2008; Lawler et al, 2005; Kealy et al, 2002)
• ограничаването на приема на калории и протеин може да удължи живота (Lawler et al, 2008; Masoro, 2005; Kealy et al, 2002)
• физическото натоварване, съобразено с възможностите на кучето, може да спомогне за компенсиране на спада на базалната метаболитна енергия, наблюдаван с възрастта и да потенцира поддържането на оптимално тегло (Adams et al., 2018; Harper, 1998)
• оценката за състоянието на тялото и оценката за състоянието на мускулната маса, оценявани по скалата от 1-9, могат да насочат ветеринарните специалисти и собствениците дали кучето се намира в златната среда (ниво 4-5 в зависимост от неговото ежедневие и дали участва в спортни дисциплини) (WSAVA, 2020)

След като вече сме се докоснали до част от знанието и виждаме колко много неща трябва нашата система да се съобрази, ще може ли изобщо да бъде подобрена? Ако удължим живота на тъканта, ще се удължи ли и на съзнанието? Това вероятно е по-сложен въпрос от това как е възникнал живота на Земята. Виждаме, че можем да повлияем когнитивните функции на мозъка. Можем да модулираме паметта. Но, можем ли в действителност да се предпазим от разрухата на съзнанието. Нека го разгледаме така-ако когнитивните ни умение също имат нужда от удължаване на живота-то дали не би трябвало да е с допълнително хапче? 
​
Тялото, колкото и да удължаваме неговата тленност, винаги ще намери механизъм в който да завърши кръговрата си. Дори ако се замислим към днешна дата можем да удължим живота си като се предпазваме от вируси, има ваксини, медикаменти, присаждане на органи. Това е версията на удължаване на живота към днешна дата. Но, как се борим със стреса, например? С една от световните пандемии на съзнанието. Може ли да се окажем затворници на недостатъчно развито съзнание в тяло което отдавна се старае да не се изхаби. Дали нашите животни си задават тези въпроси-вероятно не, но е важно ние да мислим за доброто и качеството на всеки един живот. 

Не случайно в биологията има цикличност. Можем да контролираме, да насочваме, но не и изцяло да променим едно ниво на биологията, без да сме готови да променим и останалите.

Дали бихме били така изкусни в своето знание, че да можем да повлияем един, дори и консервативен механизъм, във всички организми? Дали тази фина настройка обаче не ни убягва и е само част от големият пъзел наречен щастлив живот.

д-р Кристиана Амирова, Доктор по биотехнологии

д-р Ралица Грънчарова-Хил, ДВМ, СВА, СВБМА

Източници:
Adams, V. J., Morgan, D. M., & Watson, P. (2018). Healthy ageing and the science of longevity in dogs. Part II: a life course perspective. Companion Animal, 23(9), 514-522.
Adwan Shekhidem, H., Sharvit, L., Leman, E., Manov, I., Roichman, A., Holtze, S., M. Huffman, D., Y. Cohen, H., Bernd Hildebrandt, T., Shams, I., & Atzmon, G. (2019). Telomeres and Longevity: A Cause or an Effect? International Journal of Molecular Sciences, 20(13). 
Aman, Y., Schmauck-Medina, T., Hansen, M., Morimoto, R. I., Simon, A. K., Bjedov, I., Palikaras, K., Simonsen, A., Johansen, T., Tavernarakis, N., Rubinsztein, D. C., Partridge, L., Kroemer, G., Labbadia, J., & Fang, E. F. (2021). Autophagy in healthy aging and disease. Nature Aging, 1(8), 634–650. 
Angelini, G., Castagneto-Gissey, L., Salinari, S., Bertuzzi, A., Anello, D., Pradhan, M., Zschätzsch, M., Ritter, P., Le Roux, C. W., Rubino, F., Basso, N., Casella, G., Bornstein, S. R., Tremaroli, V., & Mingrone, G. (2022). Upper gut heat shock proteins HSP70 and GRP78 promote insulin resistance, hyperglycemia, and non-alcoholic steatohepatitis. Nature Communications, 13(1), 7715. 
Castner, S. A., Gupta, S., Wang, D., Moreno, A. J., Park, C., Chen, C., Poon, Y., Groen, A., Greenberg, K., David, N., Boone, T., Baxter, M. G., Williams, G. V., & Dubal, D. B. (2023). Longevity factor klotho enhances cognition in aged nonhuman primates. Nature Aging, 3. 
Craft, S., & Stennis Watson, G. (2004). Insulin and neurodegenerative disease: shared and specific mechanisms. The Lancet Neurology, 3(3), 169–178. 
Deelen, J., Evans, D. S., Arking, D. E., Tesi, N., Nygaard, M., Liu, X., Wojczynski, M. K., Biggs, M. L., van der Spek, A., Atzmon, G., Ware, E. B., Sarnowski, C., Smith, A. V., Seppälä, I., Cordell, H. J., Dose, J., Amin, N., Arnold, A. M., Ayers, K. L., & Barzilai, N. (2019). A meta-analysis of genome-wide association studies identifies multiple longevity genes. Nature Communications, 10(1), 1–14. 
Deyama, S., Kondo, M., Shimada, S., & Kaneda, K. (2022). IGF-1 release in the medial prefrontal cortex mediates the rapid and sustained antidepressant-like actions of ketamine. Translational Psychiatry, 12(1), 1–10. 
Fan, S., Yan, Y., Xia, Y., Zhou, Z., Luo, L., Zhu, M., Han, Y., Yao, D., Zhang, L., Fang, M., Peng, L., Yu, J., Liu, Y., Gao, X., Guan, H., Liu, H., Wang, C., Wu, X., Zhu, H., & Cao, Y. (2023). Pregnane X receptor agonist nomilin extends lifespan and healthspan in preclinical models through detoxification functions. Nature Communications, 14(1). 
Gao, X. K., Rao, X. S., Cong, X. X., Sheng, Z. K., Sun, Y. T., Xu, S. B., Wang, J. F., Liang, Y. H., Lu, L. R., Ouyang, H., Ge, H., Guo, J., Wu, H., Sun, Q. M., Wu, H., Bao, Z., Zheng, L. L., & Zhou, Y. T. (2022). Phase separation of insulin receptor substrate 1 drives the formation of insulin/IGF-1 signalosomes. Cell Discovery, 8(1). 
Grabowska, W., Sikora, E., & Bielak-Zmijewska, A. (2017). Sirtuins, a promising target in slowing down the ageing process. Biogerontology, 18(4), 447–476. 
Greer, K. A., Canterberry, S. C., & Murphy, K. E. (2007). Statistical analysis regarding the effects of height and weight on life span of the domestic dog. Research in veterinary science, 82(2), 208-214.
Greer, K. A., Hughes, L. M., & Masternak, M. M. (2011). Connecting serum IGF-1, body size, and age in the domestic dog. Age, 33, 475-483.
Halioua, C., (2023 November 28). “FDA Center for Veterinary Medicine agrees Loyal’s data supports reasonable expectation of effectiveness for large dog lifespan extension”. Loyal for dogs. 
Hansen, M., Rubinsztein, D. C., & Walker, D. W. (2018). Autophagy as a promoter of longevity: insights from model organisms. Nature Reviews. Molecular Cell Biology, 19(9), 579–593. 
Harper, E. J. (1998). Changing perspectives on aging and energy requirements: aging, body weight and body composition in humans, dogs and cats. The Journal of nutrition, 128(12), 2627S-2631S.
Imai, S., & Guarente, L. (2016). It takes two to tango: NAD+ and sirtuins in aging/longevity control. Npj Aging and Mechanisms of Disease, 2(1). 
Jiang, B., Wu, X., Meng, F., Si, L., Cao, S., Dong, Y., Sun, H., Lv, M., Xu, H., Bai, N., Guo, Q., Song, X., Yu, Y., Guo, W., Yi, F., Zhou, T., Li, X., Feng, Y., Wang, Z., & Zhang, D. (2022). Progerin modulates the IGF-1R/Akt signaling involved in aging. Science Advances, 8(27). 
Johnson, S. C., Sangesland, M., Kaeberlein, M., & Rabinovitch, P. S. (2015). Modulating mTOR in aging and health. Aging and health-A systems biology perspective, 40, 107-127.
Kaeberlein, M. (2014). Rapamycin and aging: when, for how long, and how much?. Journal of genetics and genomics, Yi chuan xue bao, 41(9), 459.
Kaeberlein, M., Creevy, K. E., & Promislow, D. E. (2016). The dog aging project: translational geroscience in companion animals. Mammalian genome, 27, 279-288.
Kealy, R. D., Lawler, D. F., Ballam, J. M., Mantz, S. L., Biery, D. N., Greeley, E. H., ... & Stowe, H. D. (2002). Effects of diet restriction on life span and age-related changes in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, 220(9), 1315-1320.
Kerr, A., & Baxter, R. C. (2022). Noncoding RNA actions through IGFs and IGF binding proteins in cancer. Oncogene, 41(25), 3385–3393. 
Kourtis, N., Nikoletopoulou, V., & Tavernarakis, N. (2012). Small heat-shock proteins protect from heat-stroke-associated neurodegeneration. Nature, 490(7419), 213–218. 
Kurosu, H. (2005). Suppression of Aging in Mice by the Hormone Klotho. Science, 309(5742), 1829–1833. 
Kwon, H., Choi, M., Ahn, Y., Jang, D., & Pak, Y. (2022). Flotillin-1 palmitoylation turnover by APT-1 and ZDHHC-19 promotes cervical cancer progression by suppressing IGF-1 receptor desensitization and proteostasis. Cancer Gene Therapy, 30(2), 302–312. 
Ladraa, S., Zerbib, L., Bayard, C., Fraissenon, A., Venot, Q., Morin, G., Garneau, A. P., Isnard, P., Chapelle, C., Hoguin, C., Fraitag, S., Duong, J.-P., Guibaud, L., Besançon, A., Kaltenbach, S., Villarese, P., Asnafi, V., Broissand, C., Goudin, N., & Dussiot, M. (2022). PIK3CA gain-of-function mutation in adipose tissue induces metabolic reprogramming with Warburg-like effect and severe endocrine disruption. Science Advances, 8(49). 
Lawler, D. F., Evans, R. H., Larson, B. T., Spitznagel, E. L., Ellersieck, M. R., & Kealy, R. D. (2005). Influence of lifetime food restriction on causes, time, and predictors of death in dogs. Journal of the American Veterinary Medical Association, 226(2), 225-231.
Lawler, D. F., Larson, B. T., Ballam, J. M., Smith, G. K., Biery, D. N., Evans, R. H., ... & Kealy, R. D. (2008). Diet restriction and ageing in the dog: major observations over two decades. British Journal of Nutrition, 99(4), 793-805.
Lee, M. B., Hill, C. M., Bitto, A., & Kaeberlein, M. (2021). Antiaging diets: Separating fact from fiction. Science, 374(6570). 
Lin, J.-R., Sin-Chan, P., Napolioni, V., Torres, G. G., Mitra, J., Zhang, Q., Jabalameli, M. R., Wang, Z., Nguyen, N., Gao, T., Laudes, M., Görg, S., Franke, A., Nebel, A., Greicius, M. D., Atzmon, G., Ye, K., Gorbunova, V., Ladiges, W. C., & Shuldiner, A. R. (2021). Rare genetic coding variants associated with human longevity and protection against age-related diseases. Nature Aging, 1(9), 783–794. 
Lin, K., Hsin, H., Libina, N., & Kenyon, C. (2001). Regulation of the Caenorhabditis elegans longevity protein DAF-16 by insulin/IGF-1 and germline signaling. Nature Genetics, 28(2), 139–145. 
Locatelli, A., & Cenci, S. (2022). Autophagy and longevity: Evolutionary hints from hyper-longevous mammals. Frontiers in Endocrinology, 13. 
Longo, V. D., Di Tano, M., Mattson, M. P., & Guidi, N. (2021). Intermittent and periodic fasting, longevity and disease. Nature Aging, 1(1), 47–59. 
López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., & Kroemer, G. (2013). The hallmarks of aging. Cell, 153(6), 1194-1217.
Mannick, J. B., Del Giudice, G., Lattanzi, M., Valiante, N. M., Praestgaard, J., Huang, B., ... & Klickstein, L. B. (2014). mTOR inhibition improves immune function in the elderly. Science translational medicine, 6(268), 268ra179-268ra179.
Masoro, E. J. (2005). Overview of caloric restriction and ageing. Mechanisms of ageing and development, 126(9), 913-922.
Morselli, E., Maiuri, M. C., Markaki, M., Megalou, E., Pasparaki, A., Palikaras, K., Criollo, A., Galluzzi, L., Malik, S. A., Vitale, I., Michaud, M., Madeo, F., Tavernarakis, N., & Kroemer, G. (2010). Caloric restriction and resveratrol promote longevity through the Sirtuin-1-dependent induction of autophagy. Cell Death & Disease, 1(1), e10–e10. 
Raghavachari, N. (2020). The Impact of Apolipoprotein E Genetic Variability in Health and Life Span. The Journals of Gerontology: Series A, 75(10), 1855–1857. 
Ock, S., Ham, W., Kang, C. W., Kang, H., Lee, W. S., & Kim, J. (2021). IGF-1 protects against angiotensin II-induced cardiac fibrosis by targeting αSMA. Cell Death & Disease, 12(7), 1–10. 
Parkhitko, A. A., Filine, E., & Tatar, M. (2023). Combinatorial interventions in aging. Nature Aging, 3(10), 1187–1200. 
Peinado-Ruiz, I. C., Antonio Manuel Burgos-Molina, Sendra-Portero, F., & Ruiz-Gómez, M. A. (2022). Relationship between heat shock proteins and cellular resistance to drugs and ageing. Experimental Gerontology , 167(167), 111896–111896. 
Petralia, R. S., Mattson, M. P., & Yao, P. J. (2014). Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing research reviews, 16, 66-82.
Prather, A. A., Epel, E. S., Arenander, J., Broestl, L., Garay, B. I., Wang, D., & Dubal, D. B. (2015). Longevity factor klotho and chronic psychological stress. Translational Psychiatry, 5(6), e585–e585. 
Quarrie, J. K. (2004). Murine Models of Life Span Extension. Science of Aging Knowledge Environment, 2004(31), re5–re5. 
Ratajczak, M. Z., Shin, D.-M., Schneider, G., Ratajczak, J., & Kucia, M. (2012). Parental imprinting regulates insulin-like growth factor signaling: a Rosetta Stone for understanding the biology of pluripotent stem cells, aging and cancerogenesis. Leukemia, 27(4), 773–779. 
Salminen, A., Kaarniranta, K., & Kauppinen, A. (2021). Insulin/IGF-1 signaling promotes immunosuppression via the STAT3 pathway: impact on the aging process and age-related diseases. Inflammation Research: Official Journal of the European Histamine Research Society ... [et Al.], 70(10-12), 1043–1061. 
Salminen, A., Ojala, J., J. Huuskonen, Kauppinen, A., Tiina Suuronen, & Kaarniranta, K. (2008). Interaction of aging-associated signaling cascades: Inhibition of NF-κB signaling by longevity factors FoxOs and SIRT1. Cellular and Molecular Life Sciences, 65(7-8), 1049–1058. 
Sen, I., Zhou, X., Chernobrovkin, A., Puerta-Cavanzo, N., Kanno, T., Salignon, J., Stoehr, A., Lin, X.-X., Baskaner, B., Brandenburg, S., Björkegren, C., Zubarev, R. A., & Riedel, C. G. (2020). DAF-16/FOXO requires Protein Phosphatase 4 to initiate transcription of stress resistance and longevity promoting genes. Nature Communications, 11(1). 
Smith, T. (2023). FDA Agrees Loyal Data Supports Reasonable Expectation of Effectiveness for Large Dog Lifespan Extension.
Speakman, J. R. (2005). Body size, energy metabolism and lifespan. Journal of Experimental Biology, 208(9), 1717-1730.
Storz, P. (2006). Reactive Oxygen Species-Mediated Mitochondria-to-Nucleus Signaling: A Key to Aging and Radical-Caused Diseases. Science Signaling, 2006(332), re3–re3. 
Suh, Y., Atzmon, G., Cho, M. O., Hwang, D., Liu, B., Leahy, D. J., & Cohen, P. (2008). Functionally significant insulin-like growth factor I receptor mutations in centenarians. Proceedings of the National Academy of Sciences, 105(9), 3438-3442.
Teuscher, A. C., Statzer, C., Goyala, A., Domenig, S. A., Schoen, I., Hess, M., Hofer, A. M., Fossati, A., Vogel, V., Goksel, O., Aebersold, R., & Ewald, C. Y. (2024). Longevity interventions modulate mechanotransduction and extracellular matrix homeostasis in C. elegans. Nature Communications, 15(1), 276. 
Vila, J. (2021). Social Support and Longevity: Meta-Analysis-Based Evidence and Psychobiological Mechanisms. Frontiers in Psychology, 12. 
Vogt, M. C., & Hobert, O. (2023). Starvation-induced changes in somatic insulin/IGF-1R signaling drive metabolic programming across generations. Science Advances, 9(14). 
Wang, X., Chrysovergis, K., Kosak, J., Kissling, G., Streicker, M., Moser, G., Li, R., & Eling, T. E. (2014). hNAG-1 increases lifespan by regulating energy metabolism and insulin/IGF-1/mTOR signaling. Aging, 6(8), 690–704. 
WSAVA Global Nutrition Committee. (2020). Body condition score. WSAVA. 
Yuan, R., Tsaih, S. W., Petkova, S. B., De Evsikova, C. M., Xing, S., Marion, M. A., & Paigen, B. (2009). Aging in inbred strains of mice: study design and interim report on median lifespans and circulating IGF1 levels. Aging cell, 8(3), 277-287.
Zhao, H., Ji, Q., Wu, Z., Wang, S., Ren, J., Yan, K., Wang, Z., Hu, J., Chu, Q., Hu, H., Cai, Y., Wang, Q., Huang, D., Ji, Z., Li, J., Belmonte, J. C. I., Song, M., Zhang, W., Qu, J., & Liu, G.-H. (2022). Destabilizing heterochromatin by APOE mediates senescence. Nature Aging, 2(4), 303–316.